壞死性凋亡：在合適的時間點(diǎn)使用合適的檢測

摘要： 

對壞死性凋亡的檢測而言，關(guān)鍵的挑戰(zhàn)在于將它與凋亡和壞死區(qū)分開。細(xì)胞很容易從凋亡轉(zhuǎn)到壞死性凋亡，反之亦然，而繼發(fā)性的壞死也往往發(fā)生在凋亡的后期階段。因此，細(xì)胞死亡的檢測要輔以實時的形態(tài)分析以及死亡通路的抑制或敲除。同時，找對采樣的時間點(diǎn)，這也很關(guān)鍵。 

在對壞死性凋亡（necroptosis）有了一定的了解之后，相信大家已經(jīng)迫不及待要開始檢測了。其實，對壞死性凋亡的檢測而言，關(guān)鍵的挑戰(zhàn)在于將它與凋亡和壞死區(qū)分開。細(xì)胞很容易從凋亡轉(zhuǎn)到壞死性凋亡，反之亦然，而繼發(fā)性的壞死也往往發(fā)生在凋亡的后期階段。因此，細(xì)胞死亡的檢測要輔以實時的形態(tài)分析以及死亡通路的抑制或敲除。同時，找對采樣的時間點(diǎn)，這也很關(guān)鍵。

質(zhì)膜完整性受損

大家都知道，利用非通透性的DNA結(jié)合染料（如DAPI、PI或7-AAD）能鑒定細(xì)胞死亡時的質(zhì)膜完整性受損。當(dāng)質(zhì)膜破裂時，這些染料進(jìn)入細(xì)胞并與DNA相結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀和成像流式細(xì)胞儀能夠提供細(xì)胞大小和形態(tài)的信息，幫助區(qū)分活的、壞死和凋亡的細(xì)胞。在壞死性凋亡的早期階段，細(xì)胞腫脹導(dǎo)致前向和側(cè)向散射增加，但隨著質(zhì)膜破裂和細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏而迅速減少。 

通過annexin V和PI的雙染色可將細(xì)胞分為健康（annexin V和PI陰性）、早期凋亡（annexin V陽性，PI陰性）以及晚期凋亡/繼發(fā)性的壞死和壞死性凋亡（annexin V和PI陽性）。分析形態(tài)上的差異，可進(jìn)一步區(qū)分這些細(xì)胞（下圖）。壞死性凋亡的細(xì)胞顯示出彌散的PI染色和強(qiáng)烈的熒光信號，而經(jīng)歷晚期凋亡/壞死的細(xì)胞則出現(xiàn)收縮。

細(xì)胞內(nèi)含物檢測

細(xì)胞內(nèi)含物的存在也可以說明組織和器官中的細(xì)胞死亡，比如乳酸脫氫酶（LDH）或線粒體DNA，但僅憑這些組分并不能說明細(xì)胞通過哪種途徑死亡。高遷移率族蛋白（HMGB1）、IL-1α、IL-33和親環(huán)素A的釋放可能表明壞死性凋亡發(fā)生，但這種現(xiàn)象也存在于巨噬細(xì)胞活化或全面凋亡中。因此，我們還是有必要通過延時視頻顯微鏡或透射電子顯微鏡來實時評估細(xì)胞形態(tài)，證實細(xì)胞的死因是壞死性凋亡。

羅丹明123、四甲基羅丹明甲酯（TMRM）、四甲基羅丹明乙酯（TMRE）以及JC-1等熒光探針都可以在具有完整膜電位（即非凋亡或非壞死）的線粒體中發(fā)出明亮的熒光。而在壞死性凋亡的早期階段，線粒體膜電位的超級化導(dǎo)致熒光瞬時增加。質(zhì)膜破裂使膜電位消失，導(dǎo)致相應(yīng)的熒光下降。這些數(shù)據(jù)可通過流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或熒光讀板機(jī)測得。

形態(tài)上的變化

在經(jīng)歷死亡這個過程時，細(xì)胞的形態(tài)是不斷變化的。因此，隨著時間的變化不斷測定，才能確認(rèn)壞死性凋亡。延時視頻顯微鏡能夠?qū)蝹€細(xì)胞的形態(tài)變化與分子、亞細(xì)胞和生化事件相關(guān)聯(lián)，從而區(qū)分壞死性凋亡和凋亡。PI等非通透性的DNA結(jié)合染料，可以確定質(zhì)膜通透性，并區(qū)分壞死和壞死性凋亡。不過，大家最好優(yōu)化一下實驗，以避免光毒性，最大限度減少實驗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。通常，減少暴露時間，降低光源電壓和相機(jī)上的像素合并都能減少細(xì)胞損傷的風(fēng)險。

透射電子顯微鏡盡管耗時又昂貴，但通常被認(rèn)為是評估形態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)，因為它能夠以高分辨率產(chǎn)生細(xì)胞形態(tài)的圖像。不過，制備過程可能會損害細(xì)胞形態(tài)，為此需要采用其他的方法來維持細(xì)胞完整性。Vanden Berghe等人曾在2013年提出一種方法，利用附著在組織培養(yǎng)板底部的巨噬細(xì)胞來捕獲瀕死的細(xì)胞。

抑制和敲除

廣譜的caspase抑制劑，如zVAD-fmk或Q-VD-Oph，往往被用來阻斷caspase激活，或證實壞死性凋亡的發(fā)生。盡管這些抑制劑能夠阻斷大部分的外部信號，但可能無法完全阻斷內(nèi)部途徑，其中caspase的作用是在線粒體膜電位發(fā)生不可逆損失之后加速細(xì)胞死亡。

此外，人們也采用RIPK1抑制劑（necrostatin-1）和MLKL抑制劑（necrosulfonamide）來阻斷壞死性凋亡。不過，necrostatin-1可能在某些細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且在區(qū)分壞死性凋亡和凋亡上不夠特異。因此，需要額外的敲除策略來補(bǔ)充抑制實驗的數(shù)據(jù)。敲除RIPK3或MLKL可以阻斷壞死性凋亡，但也可能使細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另外一條死亡途徑。因此，在敲除發(fā)生后分析細(xì)胞死亡的類型是很重要的。

當(dāng)然，我們也可以利用western blot、免疫組化或流式細(xì)胞儀來檢測壞死性凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，比如RIPK3、RIPK1和MLKL，來支持形態(tài)學(xué)實驗結(jié)果。磷酸化MLKL（Ser358和Thr357）是最精確的蛋白，可確認(rèn)壞死性凋亡是通過RIPK3介導(dǎo)的MLKL激活。此外，RIPK1/ procaspase-8的高比例也說明了環(huán)境有利于壞死性凋亡。

盡管壞死性凋亡是目前研究最透徹的程序性壞死，但其他受調(diào)控的細(xì)胞死亡也被確定，包括細(xì)胞焦亡（pyroptosis）、鐵死亡（ferroptosis）、parthanatos、親環(huán)蛋白D依賴的壞死等。這些通路并非孤立的，因此在未來研究程序性細(xì)胞死亡的通路時，有必要考慮通路之間的串?dāng)_和互作。如此看來，對于細(xì)胞是如何死亡的，即使是福爾摩斯也要動一番腦筋啊。