IHC全攻略：問題到底出在哪兒？

發(fā)布者：biolead 發(fā)布時(shí)間：2019-10-19 分享到：

從技術(shù)上說，IHC和ICC實(shí)驗(yàn)并不難，然而，每個(gè)實(shí)驗(yàn)又有那么多的變量需要鑒定和優(yōu)化。若運(yùn)氣不佳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不太好，那么我們可能要做個(gè)troubleshooting，看看問題到底出在哪兒。下表就列出了IHC/ICC實(shí)驗(yàn)的常見問題，以及相應(yīng)的對策。

問題1：缺乏染色

可能原因	對策
缺乏抗原	通過原位雜交檢查蛋白表達(dá)。
因儲存不當(dāng)，抗體不起作用	按照說明書上的說明儲存。一般來說，將抗體分裝成小份，足夠單次實(shí)驗(yàn)使用。將這些抗體儲存在手動(dòng)除霜的冰箱中（-20 to -70 °C），避免反復(fù)凍融。
一抗或二抗失活	獨(dú)立檢測報(bào)告系統(tǒng)，以評估試劑是否有用。
組織固定不足	嘗試增加固定時(shí)間或換一種固定劑。
組織過度固定	減少浸潤或固定后步驟的持續(xù)時(shí)間。如果浸潤固定無法避免，那么通過抗原修復(fù)試劑，讓抗原不被遮蔽。
一抗與二抗不兼容	使用能與一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗來自兔子，那么就使用抗兔的二抗。
在固定或包埋過程中表位已改變	通過各種抗原修復(fù)技術(shù)嘗試恢復(fù)免疫反應(yīng)性。在58°C或以下包埋組織。
抗原修復(fù)不起作用	增加處理時(shí)間或改變處理溶液。
試劑遺漏或順序不對	重復(fù)染色過程，確認(rèn)使用了正確的試劑，并以正確順序添加。

問題2：高背景

可能原因	對策
一抗或二抗的濃度高	滴定抗體，以確定促進(jìn)一抗和二抗的特異反應(yīng)所需的最佳濃度。
組織中抗體和蛋白的疏水相互作用	降低抗體稀釋液的離子強(qiáng)度（特別是單克隆抗體）。
一抗或二抗與組織的非特異結(jié)合	在一抗孵育之前采用封閉步驟（通常使用1% BSA和10% 正常驢血清）。脫脂奶粉也是個(gè)選擇。
二抗的非特異結(jié)合	使用交叉反應(yīng)性IgG被去除的抗體。
組織變干	在染色過程中避免讓組織變干。
離子相互作用引起的背景	提高稀釋液的離子強(qiáng)度。

問題3：細(xì)胞/組織形態(tài)被破壞

可能原因	對策
抗原修復(fù)方法太過劇烈	根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)條件，既能保留組織形態(tài)，又能恢復(fù)抗原的免疫反應(yīng)性
組織切片從玻片上脫落	增加固定時(shí)間。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定另一種固定劑。
組織切片撕裂或折疊。切片下有氣泡	重新切片，或在分析結(jié)果時(shí)忽略受損區(qū)域。
組織形態(tài)的分辨率差	切出更薄的組織切片。冰晶可能會(huì)破壞冰凍切片的形態(tài)。
固定不足在染色過程中會(huì)導(dǎo)致組織或細(xì)胞受損	延長固定時(shí)間。提高固定劑/組織的比例。切出更小的組織，以便更徹底的浸潤。
組織自溶導(dǎo)致壞死碎片的染色	延長固定時(shí)間、比例。考慮使用交聯(lián)的固定劑。

問題4：染色不當(dāng)

可能原因	對策
固定方法不當(dāng)	嘗試另一種固定劑，或延長固定時(shí)間。
抗原修復(fù)可能不當(dāng)	嘗試另一種抗原修復(fù)條件。
抗原的靜電荷被改變	嘗試調(diào)整抗體稀釋液的pH或陽離子濃度。
固定拖延導(dǎo)致抗原擴(kuò)散	快速固定組織。嘗試交聯(lián)固定劑，而不是有機(jī)固定劑。